Основи на молекуларна терапија. генска терапија

Видео: Молекуларната основа на индивидуализацијата на терапијата со чести мутации кај NSCLC

Cодржина

Видео: Молекуларната основа на индивидуализацијата на терапијата со чести мутации кај nsclc
генска терапија

Воспоставување на локацијата и секвенца на генот чии мутации предизвикуваат одредени болести, како и најсовремени методи на мутација и нејзино тестирање може да се дијагностицира болеста во нео-, па дури и пренаталниот развој на организмот. Ова го прави можно да се ублажат манифестација на генетски дефект со третман со лекови, исхрана, трансфузија на крв, итн

Сепак, овој пристап не доведе до отстранување на дефектот и, генерално, наследна болест не може да се излечи. Ситуацијата е комплицирана од фактот дека мутација на еден ген може да се произведуваат различни ефекти врз телото. Ако мутација предизвикува промена во ензимската активност за која кодови, тоа може да доведе до акумулација на токсични супстрат или, пак, на недостаток на соединение потребно за нормално функционирање на клетките.

А добро познат пример на таква болест фенилкетонурија. Таа е предизвикана од мутација на ген за црниот дроб ензим fenilalanindegidroksilazy катализира конверзијата на фенилаланин да тирозин. Резултатот е зголемена ендогени ниво на фенилаланин во крвта, што предизвикува неправилно формирање на миелинската обвивка околу аксоните на нервните клетки на централниот нервен систем и како резултат на тоа, тешка ментална ретардација.

Ако мутација влијае протеини ген структурните, тогаш ова може да доведе до сериозни нарушувања на ниво на клетки, ткива или органи. Еден пример на таква болест е цистична фиброза.

На бришење во генот кој го кодира протеинот наречен цистична фиброза транспортерот води до синтеза на дефектен протеин (недостаток на фенилаланин 508) и нарушувања на транспорт на хлорид јони преку клеточната мембрана. Еден од најпознатите штетни последици од ова е дека на слуз кој линии и ги штити белите дробови, станува ненормално дебел. Ова го отежнува пристапот до клетките на белите дробови и придонесува за акумулација на штетни микроорганизми. Клетките поставата на дишните патишта на белите дробови, се убиени и се заменува со фиброзно ткиво со лузни (оттука и името на болеста). Како резултат на тоа, пациентот умира од респираторна инсуфициенција.

Наследни болести се разликуваат комплекс клинички симптоми и нивниот третман traditsinnoe главно симптоматично: за лекување на фенилкетонурија bezalaninovuyu пропишува начинот на исхрана, замена на дефектните функционални протеини со интравенска администрација, да ги надоместат загубените функции врши трансплантација на коскена срцевина или други органи. Сите овие мерки вообичаено се неефикасни, скапи, трајни, и неколку пациенти преживуваат до старост. Затоа, развој на нови терапии е многу итно.

генска терапија

Генска терапија се нарекува генетски инженеринг на човековите соматски клетки, во насока на корекција на генетски дефект што ја предизвикува болеста. Корекција на одредени болести се врши со воведување во неисправна клетките на нормалните соматски изрази гени. На 80-години. Кога се создадени развиени методи за подготовка на поединечни гени и еукариотски израз вектори, станува рутина експерименти генот трансфер во глувци, генетски перспектива корекција стане реално.

Во 1990 година во САД од страна на д-р В. францускиот Андерсон (В. францускиот Andrson) првиот обид за генска терапија за третман на тешка комбинирана имунодефициенција (SCID) во три години девојка Ашанти де Силва (Ashanthi Силва) беа направени. Оваа болест е предизвикана од мутација во adenozanadenilazu генот кој шифрира (ADA). Недостаток на овој ензим го олеснува акумулација на аденозин и деоксиаденозин крв, токсични акција на која води до смрт на Б и Т-лимфоцити во периферната крв и, како последица на имунодефициенција.

Децата со оваа болест треба да бидат заштитени од било инфекции (содржани во посебни стерилни комори), како и секоја болест може да биде фатална. 4 години по почетокот на третманот на детето има забележано израз на нормално функционирање SCID АДА и олеснување на симптомите, која е дозволено да ја напушти стерилен комора и да живее нормален живот.

Така, тоа е докажано во принцип можноста за успешна генска терапија на соматски клетки. Од 90-тите години. тестирани голем број на генска терапија на генетски болести, меѓу кои се најтешки, како хемофилијата, СИДА, разни видови на малигни неоплазми, цистична фиброза и други. Во моментов се лекува преку transgenesis околу 10 човечки болести.

А сорта на генетски болести предодредено множество на развој на генска терапија пристапи. Така реши два главни проблеми: средство за обезбедување на терапевтски gena- метод за обезбедување насочени испорака на ќелии наменети за корекција. До денес, сите пристапи за генска терапија на соматски клетки може да се подели во две категории: (. Слика 3.15) ex vivo терапија и ин виво.

Сл. 3.15. Шема на ex vivo генска терапија (а) и in vivo (а)

ex vivo генска терапија вклучува корекција на генетски дефект на клетките надвор од телото, а потоа се врати на нормално функционирање на клетките во телото.

in vivo генска терапија вклучува испорака на терапевтски ген директно во клетки на специфично ткиво на пациентот. Сметаат дека овие пристапи во повеќе детали.

ex vivo генска терапија вклучува следните чекори:
1) обезбедување на дефицит на клетки на пациентот и да ги култивирање;
2) пренесување на саканата ген во изолираните клетки од страна на трансфекција на терапевтскиот ген конструкт;
3) селектирање и капацитет генетски корегирана клетки;
4) трансплантација или трансфузија на овие клетки во пациентот.

Користење на сопствените клетки на пациентот гарантира дека по нивното враќање, тој не се развие имунолошкиот одговор. Пренос на постапката, ген конструкција треба да бидат ефективни, но нормален ген треба да се одржува стабилно и континуирано да се изрази.

Средства за ген трансфер создадени од природата, се вируси. Со цел да се добие ефикасна вектори ген испорака за две група на вируси се користат главно - (. Види Слика 3.16) аденовируси и ретровирусите. детоксифицира генетски варијанти на вируси кои се користат во генска терапија.

Сл. 3.16. Вируси се користи за создавање на терапевтски вектори

Се разгледа на уредот и на употребата на дизајни базирани на ретро-вируси. Потсетиме дека ретровирусен геном содржи два идентични РНК молекули, од кои секоја се состои од шест делови: две долго терминално повторување (LTR) на 5` и 3` завршува секвенца noncoding * P + потребно за пакување на RNA во вирална честичка, и три региони шифрира структурен протеин на внатрешниот капсид (виц), реверзна транскриптаза (pol) и плик протеин (env) (Сл. 3.17, a).

Сл. 3.17. На генетска мапа на еден типичен ретровирус (а) и карта ретровирусен вектор (а)

Потсетиме дека ретровирус на животниот циклус се состои од следниве чекори:
1. Инфекција на целните клетки.
2. синтезата на ДНК примерок од геномот со мајчин реверзна транскриптаза.
3. транспорт на вирусната ДНК во јадрото.
4. Интеграција на вирусна ДНК во хромозом на клетката домаќин.
5. Уредување на mRNA од вирусна ДНК под контрола на силен промотор локализирана на 5`-LTR дел.
6. пренос протеини Gag, Пол и Плик бр.
7. формирање на вирусна капсид и пакет две РНК молекули синџири и реверзна транскриптаза.
8. ослободување на вирионите од клетката.

Во подготовка на ретровирусен вектор должината на ДНК ретро вирусот вметнат во плазмид отстрани повеќето од генот на замолчени и целосно гени Pol и Env, и наместо вметнува "терапевтски" ген T и евентуално маркер селективен Rg ген со свој промоторот (Сл. 3.17, b ). Уредување ген T ќе бидат контролирани од страна на истиот силен промотор локализирани 5`-LTR дел. Врз основа на оваа шема обезбедува различни ретровирусна вектори и максималната големина на инсертот на ДНК од околу осум илјади. Bp

Добиени на тој начин структура може да се користи само по себе за трансформација, но неговата ефикасност и последователните интеграцијата во геномот на клетката домаќин е исклучително низок. Затоа, техника за пакување вкупното RNA ретровирусен вектор во недопрена виралните честички кои беше развиен, кои со висока фреквенција во клетка и да навлезат гарантиран интегриран во геномот на домаќинот. За оваа т.н. "pakuyuschaya" клеточна линија е основана. На две различни делови на хромозомите на клетките пораби вирусните гени gag и pol-env, лишени од способноста да се спакуваат поради недостаток на конзистентност + (84 +) (Сл. 3.18).

Сл. 3.18. На шемата за добивање на спакувани вирусен вектор

Тоа е, и двете од овие фрагменти се транскрибира, но во исто време се лишени од РНК празни capsids. Со трансфектирање на вирусен вектор РНК во таквите клетки, што е вклучена во хромозомски ДНК и е транскрибирана за да се произведе RNA ретровирус целосна должина, и под тие услови спакувани во capsids од само RNA вектор (само што содржи секвенца +). што резултира недопрена вирус на честички се користат за ефикасна испорака на ретровирусен вектор во целната клетка.

Ретровируси зарази само активно клетките опширно. За пренос на нивните гени беше третирана со прочистен честички од спакувани ретровирусен вектор или ко-културирани со клеточна линија производство на нив, а потоа се врши избор за одвојување на целните клетки и клеточни на пакувањето.

Трансдуцирани клетки се темелно проверени за нивото на синтезата на терапевтски ген производ, отсуство на надлежните ретровирус репликација, нема промени во способноста на клетките да растат или функција.

Особено погоден за генска терапија се клетките на коскената срцевина. Ова се должи на присуството на тотипотентни ембрионски матични клетки, кои можат да се размножуваат и се разликува во различни видови -B- клетки и Т лимфоцитите, макрофагите, еритроцити, тромбоцити и остеокласти. Овие клетки се користат за лекување на голем број на наследни болести, меѓу кои веќе ги споменавме тешка комбинирана имунодефициенција, Gaucher-овата болест, српеста анемија, таласемија, остеопороза и други.

Покрај тотипотентни коскената срцевина матични клетки, кои се тешко да се изолираат и да се посветам на користени pupovinnoy матични клетки од крв (склопот на употреба на генетска терапија за доенчиња) и клетките на црниот дроб - хепатоцитите - за третман на хиперхолестеролемија.

Во ин виво ген терапија е особено важно да се обезбеди испорака на терапевтски ген на неисправни клетки. Таквите насочени испорака може да се обезбеди модифицирано вектори, кои се базирани на вируси кои можат да се појават одредени типови на клетки. Размислете за пристап развиени за третман на веќе споменавме погоре цистична фиброза. Од белите дробови се отворени празнина, терапевтски гени за реализација нив е релативно лесно. Клониран варијанта на здрав ген е воведен во инактивиран аденовирус (Сл. 3.19). Специфичноста на овој тип на вирус е тоа што инфицира обвивката на белите дробови, што предизвикува настинка.

Сл. 3.19. Шема за добивање на вектор врз основа на аденовирус

Дизајниран така што вирусот беше тестирана од страна прскање во носот и белите дробови на експериментални животни, а потоа луѓето пациенти. Во некои случаи, воведување и изразување на здрав ген, и враќање на нормална транспорт на хлоридни јони. Можеби овој пристап (воведување на нормален ген од носната спрејови) во блиска иднина ќе биде широко се користи за лекување на симптомите на цистична фиброза во белите дробови.

Покрај retro- и аденовируси во генската терапија експерименти на употреба и други видови на вируси, како на пример херпес симплекс вирусот. А карактеристика на овој двојно верижен (152 илјади. БП) ДНК вирус е во неговата способност да ги конкретно погоди неврони. Постојат многу генетски болести кои влијаат на централниот и периферниот нервен систем - тумори, метаболички нарушувања, невродегенеративни заболувања (на Алцхајмерова болест, Паркинсонова болест).

Херпес симплекс вирус тип I (HSV) вектор е многу погодна за лекување на овие заболувања. Капсидните на вирусот осигурувачи со мембраната на невронот, а неговата ДНК се транспортира во јадрото. Тоа сугерира неколку начини на пренесување на терапевтски ген преку ХСВ-вектори и успешно тестиран кај експерименталните животни.

Вирусни вектори имаат неколку недостатоци: високата цена, ограничениот капацитет на клонирани и можните воспалителни реакции. Така, во 1999 година, како резултат на што се разви невообичаено силен имунолошки одговор на векторот на аденовирус беше убиен 18-годишниот волонтер, кој учествуваше во судските процеси на дрога. Во 2002 година, две деца во Франција за време на лекувањето на имунодефициенција (воведување на терапевтски гени во матични клетки користејќи ретровирусите) има развиено состојба слична на леукемија.

Затоа развиена nonviral систем ген испорака. Најлесен и повеќето неефикасен начин - тоа е инјектирање на плазмид ДНК во ткивото. На вториот пристап - е microprojectile бомбардирање ткаенини злато (1-3 микрони) конјугиран ДНК. Така терапевтски гените се изразени во целните ткива и нивни производи - терапевтски протеини - влезат во крвотокот. Главниот недостаток на овој пристап е предвремено деактивирање или уништување на овие протеини со крвни компоненти.

Испорака на ДНК може да се постигне од страна на пакување тоа во вештачки липидите мембрана. На добиени на тој начин сферични честички, липозоми лесно можат да навлезат преку мобилната мембрана. Липозоми создадени со различни својства, но досега на ефикасноста на таквите испорака е ниска, бидејќи повеќето од ДНК беше подложен на Лизозомални деградација. Исто така синтетизира ДНК конјугати за испорака на генетската конструкција на различни молекули способни за обезбедување на нејзината безбедност, насочени испорака и навлегување во клетката.

Во последниве години, интензивно експерименти за да се создаде вештачки хромозомот 47, кој ќе им овозможи да се вклучат голема количина на генетски материјал со целосен сет на регулаторни елементи за еден или повеќе терапевтски гени. Ова ќе го направи тоа можно да се користи геномски верзија на терапевтски ген и со тоа да се обезбеди неговата стабилност и ефикасна долгорочна изразување. Експериментите покажале дека создавањето на вештачки човечки хромозоми содржи терапевтски гени е реална, сепак, не е јасно како толку голема молекула воведен во јадрото на клетката-цел.

Главните проблеми со кои се соочуваат со генска терапија, во прилог на ризикот од сериозни имунолошки реакции се тешки за долгорочно чување и ракување на терапевтски ДНК во телото на пациентот, многу multigene болести, што ги прави тешко да наведете за генска терапија, како и ризикот од употребата на вируси како вектори.

NA Воини, TG Volova

Сподели на социјални мрежи:

Слични