Preimplantation ген дијагностика

комбинација со своите тест за анеуплоидија може да се подобри резултати на вештачко оплодување. ДНК за preimplantation genodiagnostic подготвени од поларни тело, биопсија чекор на дробење или зигот биопсија на бластоцисти.

ДНК анализа се врши на поларниот тело на постапката за ооцитот фаза II. Главниот недостаток на овој метод лежи во фактот дека, со цел да се потврди генотипот на ембрионот, се бара пренатална дијагноза. На рекомбинација на хромозомите во 1 мејотични поделба може да предизвика погрешна дијагноза. Во повеќето центри се изврши биопсија ембрион, што може да се открие болеста, наследена од другиот родител. Биопсија материјал обично добиен во чекор дробење зигот (Чекор осум клетки) селектирање на клетки 1-2. Поради тешкотиите поврзани со дијагноза на таков ограничен материјал (види. Подолу), идеално подобро биопсија бластоцисти, бидејќи содржи до 300 клетки. Покрај тоа, биопсијата може да се земе trophoblast клетки, бидејќи тие се повеќе лесно достапни и не се меша со правилен развој на ембрионот. Сепак, бластоцисти биопсија се врши не во сите центри се должи на комплексноста на одгледување на клетки во култура и намалено преживување на бластоцисти по криопрезервација. Сепак, со користење на овие методи, тоа е можно да се постигне бременост, и со текот на времето, со искуство, нивната ефикасност е веројатно да се зголеми.

Материјалот добиен на биопсија, анализирани од страна на еден од двата методи: PCR или флуоресцентна in situ хибридизација. Лаборатории за вршење на такви тестови мора да има сертификат во својот извештај укажуваат на тоа кој метод се користи, како резултат на декодирање на резултатите. Сепак, експерт за плодност е исклучително важно да се разбере молекуларни и генетски методи на preimplantation genodiagnostic, нивните апликации и нивните вродени недостатоци.

PCR

PCR е најдобро одговара за дијагноза на моногенски zabolevanij го користат за да се одреди полот на ембрионот е, исто така, иако тоа сега ќе се повеќе се користат флуоресцентни in situ хибридизација. Да се ​​идентификуваат со PCR мутација на ген, тоа е потребно пред ИВФ да знаете што да барате мутации и претходно изберете реакција услови. Во секоја реакција мора да бидат вклучени во соодветните позитивни и негативни контроли, во спротивно резултатите не може да се верува. Таа мора да се запомни дека за време на реакција може да биде голем број на предизвици, вклучувајќи:

1. отсуство на PCR производ;
2. примерок контаминација;
3. губење на алели.

Покрај тоа, во многу центри, ако планирате да аплицираат за пред имплантација дијагноза PCR, имаат прибегнаа кон интрацитоплазматски сперма инјектирање, со цел да се избегнат можните грешки во дијагнозата предизвикани од воведувањето на транспарентен обвивка на дополнителните сперма.

Бидејќи бројот preimplantation genodiagnostics на шаблон ДНК за PCR не е доволно - обично неколку пикограми, додека нормално во PCR сто нанограми се користат, потребно е да се зголеми бројот на засилување циклуси. Ако PCR ДНК земени од една клетка (или повеќе клетки) често бара 35-60 циклуси, додека стандард PCR (кога износот на примерокот не е ограничувачки фактор) - околу 30. Друго решение е да PCR со вгнезден прајмери ​​(или еден вгнездени прајмер): две последователни реакции за засилување на мали количини на цел дефиниција. Во последниве години, ние се користат буквари со флуоресцентни етикетата за анализа на многу мали количини на ДНК, со што се подобрува чувствителноста на PCR е околу 1000 пати и со тоа да се намали бројот на засилување циклуси.

Да се ​​елиминира контаминација на примерокот треба да биде подготвен многу внимателно и на реакционата смеса се одржи reaktsiyu- Покрај тоа, во реакција се негативна контрола (реакција мешавина која содржи сите состојки освен ДНК). Ако не е откриена на негативната контрола PCR производот, можноста за контаминација на примерокот на странски ДНК - во овој случај, на PCR резултира со остатокот од примероците не може да се верува. Од употребата на прајмери ​​со флуоросцентна број етикетата на PCR циклуси помалку веројатноста на контаминација на примерокот подолу.

Губење алел значи дека засилена во основа една од алели, а вториот засилена многу лошо или не засилена на сите. Очигледно, ова има најголема вредност во идентификување на болеста со автозомно доминантно наследување. Ако "изгубени" доминантен алел содржи мутација, грешка во анализата може да доведе до трансфер на ембрионот во матката празнина содржи мутираниот ген. Да може истовремено да се засили различни тесно распоредени ДНК фрагмент да има висок степен на полиморфизам (повеќе PCR) Со цел да се избегне овој проблем. Исто така, како што веќе рековме, може да се подобри чувствителноста на PCR користење буквари со флуоресцентни етикетата.

Здружението preimplantation genodiagnostics Европската група за хумана репродукција и ембриологија (ESHRE) го оценува дијагностичка точност на PCR и флуоресцентна in situ хибридизација. Според години 1999-2001., Во 81 preimplantation genodiagnostic случај, по PCR се врши со користење на пренаталниот и постнаталниот diagnostika- каде грешката во дијагностицирање на болести кои се наследува менделови закони откриени во 5 случаи (6,2%). Повторено дијагностика да се потврдат резултатите се врши само половина од preimplantation дијагноза. Исто така потребно е да се земат предвид случаите каде што беше невозможно да се изврши биопсија или невозможно да се дијагностицира.

Флуоресцентна in situ хибридизација

Овој метод се состои во тоа на сондата (едно-верижна ДНК) која го носи флуоресцентни етикета, се хибридизира во ДНК од денатуриран метафаза плоча, индивидуални клетки или ткива. метод може да се користи во preimplantation ген дијагностика за:

1. ембрион парење за X-поврзани болести, не постои можност да се изврши PCR;
2. откривање на хромозомски транслокации;
3. откривање на промени во бројот на хромозомите;
4. откривање на други хромозомски абнормалности, како што анеуплоидија.

Во студијата на анеуплоидија за можните технички проблеми кои се поврзани со дефиницијата на бројот на хромозоми. Ако за анализа на индивидуалните интерфазата клетки се земаат, тоа е тешко точно да се утврди бројот на сигнали (со други зборови, хромозомите) кога issleduesh една единствена клетка. Ако гледате само еден сигнал, тоа може да значи моносомија на овој хромозом, но, исто така, се преклопуваат сигнали или дека хибридизација сондата со еден од хромозомите не успеа. Слично на тоа, присуството на три или повеќе сигнали може да значи трисомија, но може да се должи на технички проблеми: двојно гледање сигнал или абнормално флуоресценција. За продолжување на дијагностичка способност истовремено може да се примени најмалку три сонди: на X-хромозомот Y-хромозомот и autosomes еден пример 18 хромозом. Во овој случај, лабораторија секогаш треба да биде строго следење на квалитетот на хибридизација во дијагностичката точност беше високо како е можно, бидејќи се знае дека во студијата на 100 нормалните диплоидни клетки 100 пара сигнали за секој хромозом не ќе бидат во можност да се добие. Дијагностички можности ќе се прошири, дали тоа ќе биде можно да се анализираат поголем број на клетки.

Во овој метод за откривање на транслокации најчесто се користат сонди flanking транслокација или грчевито држејќи се за позиција. Бидејќи веднаш по подготовката за вештачко оплодување ооцитот поларните тела содржат кондензирана метафаза хромозомот сонди може да се користи за "слика" на хромозомите во комбинација со центромерна сонди за делови (алфа сателитски повторувања) и на одредени локуси. За жал, клетките од фаза расцеп на зигот или во фаза на бластоциста, како сонди се несоодветни бидејќи хромозоми не може да биде во метафаза и недоволно споени. Метод во кој сонди се користи за да се subtelomeric региони на хромозом-специфични хромозомски транслокација се јавува помеѓу нив, и центромерна сонда дел, проксимално во однос на местото на транслокација. Таквите сонди може да се открие во интерфазата клетки декомпензирана транслокација, но не може да се прави разлика меѓу нормален хромозом од хромозомски транслокации со компензирана.

Според извештајот на Здружението за preimplantation genodiagnostics Европската група за хумана репродукција и ембриологија, флуоресцентна in situ хибридизација даде погрешен резултат во 8 случаи на 145, кога по дијагнозата на preimplantation врши пренаталниот и постнаталниот (5,5%). Меѓу неправилна дијагноза - два случаи на трисомија, еден мозаик трисомија, со моносомија и еден компензира и декомпензирана транслокација. Покрај тоа, студијата за анеуплоидија беше неоткриени трисомија на хромозомот 21. Како што е случај со PCR потврда на флуоресцентна in situ хибридизација резултати се врши за помалку од половина од жените кои биле подложени preimplantation ген дијагностика.

Улогата на флуоресцентна in situ хибридизација во одредувањето транслокации денес не е јасно, од 50-70% од случаите, каде што родителите се носители компензира реципрочни транслокации, кога ембрионите се декомпензирана студија транслокација. Овие објавени податоци за појавата на успешна бременост по завршувањето на студиите се разликуваат значително, но според податоците од трите главни центри на фреквенцијата на бременоста во однос на преземање на едно јајце е 29%. Некои автори објави дека preimplantation ген дијагностика го намалува ризикот од спонтан aborta- но не е јасно дали тоа ја зголемува стапката на успешно завршување на бременоста во споредба со природното зачнување, бидејќи повеќе од половина од ембрионите ќе имаат абнормалности и, на тој начин, уште поверојатно, во секој случај, нема да преживее. И покрај фактот дека preimplantation ген дијагностика да се тестираат за анеуплоидија постојано се користи со вештачко оплодување, ниту еден од објавените рандомизирани проспективни студии не покажале значително зголемување на бројот на успешен исход на бременоста. ИВФ со preimplantation дијагноза - инвазивна и скапа процедура, па затоа е важно точно да се разграничат практична улога на овој метод.

Здружение за preimplantation genodiagnostics Европската група за хумана репродукција и ембриологија

Извлече праведни заклучоци од резултатите на preimplantation genodiagnostic спроведена од страна на PCR и флуоресцентна in situ хибридизација, во пракса, тоа се уште не е секогаш можно. Според извештајот на Здружението за preimplantation genodiagnostics Европската група за хумана репродукција и ембриологија за 1999- 2001 biennium., Спроведена во 1197 година ЕКО циклуси како што е прикажано од резултатите на следните пренаталниот и постнаталниот дијагноза, preimplantation ген дијагностика користење на PCR даде погрешен резултат во 5%, и со употреба на флуоресценција in situ хибридизација - 6% од случаите. исто така да се сфати дека последователните дијагноза вршат помалку од половина од времето, така што бројот на погрешни дијагнози може да биде премногу ниска. Сепак, овие податоци не значат дека во 94% од случаите се направи соодветна дијагноза. Според Здружението, вкупната стапка на бременост по жетвата на јајца е 17%, биопсија беше успешен во 97% од случаите, дијагноза и може да се одржи само 86% од случаите. Севкупно, тоа значи дека правилната дијагноза на preimplantation дијагноза беше околу 85% од случаите. Оние кои се за да се подложат на preimplantation ген дијагностика, треба да се предупреди дека во 15% од случаите, точната дијагноза не може да се стави.